Commet assay lab ****************************************************************************************** * ****************************************************************************************** Rok pořízení 2018 - 2020 Financování OP VVV CORE FACILITIES [ URL "LFHK-192.html "] CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_017/0002515 Zodpovědná osoba prof. Ing. Zdeněk Fiala, CSc. Každá lidská činnost může být za jistých okolností zdrojem rizik pro člověka i pro životní V případě nárůstu a kumulace těchto rizik je nutno přijímat opatření, která sníží úroveň r společensky přijatelnou úroveň. Nejprve je ale nutné možné riziko charakterizovat na zákla a charakterizace nebezpečnosti a hodnocení expozice. V rámci identifikace rizika je nutné schopnost rizikového faktoru způsobovat poškození genetické informace buněk, tedy působit Pojem genotoxicita se vztahuje k látkám, faktorům nebo procesům, které poškozují strukturu informační obsah genomu a přenos informací a ovlivňují segregaci DNA či inhibují její repl genotoxicity se do značné míry překrývá proces mutagenity, který je charakterizován náhlou změnou genetické informace, přenášené do dalších generací buněk. Látky (faktory) označené indukují lokálně ohraničené léze ve struktuře DNA a pokud nejsou odstraněny buněčnými opra mohou se v průběhu replikace DNA fixovat ve stabilní mutaci. Mutace mohou vznikat buď uvni genů (genové mutace) nebo mají za následek poškození chromozomů (chromozomové mutace). Chr se mohou týkat struktury chromozomů nebo jejich počtu. Z uvedených důvodů lze o testech mu jako o testech genotoxicity. Testování karcinogenních účinků na zvířatech či analyzování karcinogenního potenciálu pomo epidemiologických studií vyžaduje vysoké náklady a nutný čas se většinou měří v rocích. Kr testy genotoxicity umožňují orientačně vymezit ze široké palety několika set tisíc existuj produkovaných (a používaných) látek ty, které svým genotoxickým působením signalizují i ex návazné nebezpečné vlastnosti - karcinogenity. Je však nutno zdůraznit, že vedle genotoxic karcinogeneze (kdy první krok v procesu je navozen poškozením DNA mutačními změnami), exis ne-genotoxické (epigenetické), které krátkodobými testy genotoxicity identifikovány být ne Výhodou krátkodobých testů genotoxicity je potenciál rychlého odhalení existence genotoxic a podle charakteru použitého testu případně i mechanismus tohoto působení. Na základě vzta genotoxickým a karcinogenním mechanismem účinku lze určením genotoxického účinku vytipovat kterým je nutno věnovat pozornost jako potenciálním karcinogenům a dále je sledovat v test epidemiologických studiích. Jedním z významných krátkodobých testů genotoxicity je test „Comet assay“ (CA), který se p zlomů v jádrech buněk. Jedná se o všestranně využitelnou, relativně jednoduchou a citlivou je v závislosti na variantě schopná detekovat jedno- i dvou-řetězcové zlomy DNA, alkali-la (apurinová/apyrimidinová místa) či inkompletní reparaci DNA, ale i oxidované purinové či p cross-link vazby či apoptické buňky. Zlomy DNA detekovatelné pomocí CA by v buňce mohly bý pro buňku letální či se v buňce fixovat za vzniku permanentní mutace. Poškození DNA lze po v suspenzi kvasnic, protozoálních, rostlinných i živočišných buněk (bezobratlí i obratlovc dělících se tak i nedělících se buněk. Obr. 1 (S) Sestava pro analýzu comet assay (fluorescenšní mikroskop a PC se SW pro analýzu měření Obr. 2 Biohazard box s laminárním prouděním disponuje dvěma pracovními místy, tedy umožňuj studentů zárověň Během CA jsou buňky umístěny v agarózovém gelu. Po lýze buněčné a jaderné membrány v solné vlivem elektroforézy k vycestování fragmentů DNA z jádra, přesněji řečeno z nukleoidu („hl čímž po vizualizaci vhodným barvivem vzniká typický obraz komety, který celé metodě dal sv je DNA fragmentovaná, tím je „ohon“ větší a delší. Fragmentovaná DNA díky svému negativním směrem k anodě. Obr. 3 Ukázka „komet“ z testu comet assay CA hodnotí míru poškození DNA genotoxickými látkami, přítomnými v životním a pracovním pro schopnost reparace poškozené DNA. Metoda je využívána v testech in vitro, in vivo a v epid studiích. Pro analýzu obvykle stačí malé množství buněk (<50 000, někteří autoři udávají i buněk). Její velkou výhodou je možnost aplikace/modifikace na téměř všechny typy buněk a t které lze na jednotlivé buňky rozdělit. Díky této skutečnosti je možné detekovat poškození které přicházejí jako první do kontaktu s karcinogeny. V neposlední řadě je nutno zmínit i jednoduchost, rychlost, cenovou nenáročnost a citlivost detekovat i malé poškození DNA. V rámci projektu CORE FACILITIES byla na Lékařské fakultě v Hradci Králové nově vybavena l testování genotoxického potenciálu různých látek (faktorů) v podmínkách in vitro, in vivo, epidemiologických studií. Laboratoř disponuje biohazard boxem s laminárním prouděním, inku atmosférou, chlazenou centrifugou, termoblokem a fluorescenčním mikroskopem s CCD kamerou umožňuje měření vybraných parametrů během analýzy CA. Autor textu: prof. Ing. Zdeněk Fiala, CSc., MUDr. Andrea Málková, Ph.D.