Laboratoř molekulárně mikrobiologických analýz ****************************************************************************************** * ****************************************************************************************** Rok pořízení 2018 - 2020 Financování OP VVV CORE FACILITIES [ URL "LFHK-192.html "] CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_017/0002515 Zodpovědná osoba prof. MUDr. Pavel Boštík, Ph.D. [ URL "https:// orcid.org/0000-0003-2691-6458"] *========================================================================================= * 8-kapilární sekvenátor ABI 3500 Genetic Analyzer *========================================================================================= Genetický analyzátor ABI 3500 se řadí mezi přístroje pro analýzu fluorescenčně značené DNA technologie kapilární elektroforézy s osmi kapilárami založené na Sangerově metodě. Sangerova metoda využívá principu PCR s fluorescenčně značenými dideoxynukleotidy. Produkt analyzovány kapilární elektroforézou a hodnoceny v tzv. sekvenogramu. V kapilárovém proved metoda v současné době stále nejpoužívanější a nejspolehlivější metodou. Při kapilárním se sekvenovány jednotlivé fragmenty DNA, připravené PCR amplifikací, s tím, že na výše uveden možnost paralelní sekvenace až 8 sekvencí. Délka získaných sekvencí je přibližně 700 bp, c 1,5% (tzn. jedna báze z cca 66 bází je přečtena chybně). V rámci molekulární mikrobiologie přístroji detekovat prakticky jakoukoliv bakterii, jejíž genom byl již sekvenován a vložen (National Center for Biotechnology Information), většinou se sekvenuje vysoce konzervativn genu. Vhodnější pro identifikaci sekvenací na tomto sekvenátoru jsou vzorky, kde se předpo pouze jedné bakterie, případně předem připravený neznámý bakteriální kmen, nikoliv vzorky bakterií více. *========================================================================================= * NGS sekvenátor MiseQ Systém *========================================================================================= Jedná se o přístroj s technikou tzv. masivního paralelního sekvenování (MPSS - z anglickéh Parallel Signature Sequencing“). Tato technika umožňuje univerzálně charakterizovat a kvan nukleové kyseliny, ať už mikrobů, zvířat nebo lidí. Nukleová kyselina je rozdělena na frag délce, z nichž každý fragment je amplifikován samostatně a mnoho takto vzniklých kopií kaž je poté čteno technologií podle použité platformy. Jednoduše řečeno, touto technikou je mo nikoliv jeden druh nukleové kyseliny jako u Sangerova sekvenování, ale desítky až stovky d schéma je následující: Příprava sekvenační knihovny, sekvenování a detekce nukleotidů, sof získaných dat. Obzvláště výhodné je použití v mikrobiologii při analýze tzv. mikrobimů, což je výraz pro mikrobů, zejména bakterií nebo kvasinek, které jsou přítomny běžně v různých ústrojích člo jednat o střevní, vaginální nebo kožní a další mikrobiom. Velkou výhodou je že NGS sekveno detekovat takřka veškeré bakterie, které jsou například přítomné ve stolici a to i takové, pěstovat na umělých půdách, tzv. živných médiích nebo agarech, čili není možné je prokázat Poměrně dobře je známo, že ve střevním mikrobiomu člověka se nachází až několik stovek dru kultivačně lze prokázat často pouze několik jednotek, maximálně desítek z nich. Právě poro střevního mikrobiomu například od pacientů se zánětlivými střevními chorobami s mikrobiome lidí může být nápomocné ve vývoji léčby pro nemocné jedince. Opakovaně se zjistilo, že u r včetně zánětlivých onemocnění střeva se vyskytuje podobná skupina bakterií, která zhoršuje anebo naopak určitá skupina bakterií pro lepší průběh nemoci chybí. V takovém případě pak skupinu bakterií potlačit specifickými léčivy anebo naopak dodat žádoucí skupinu bakterií probiotik. Přístroj vzhledem k výše uvedenému generuje enormní množství dat, pro jejichž zpracování d výpočetní stanicí s úložištěm. *========================================================================================= * GeneXpert IV - 4L automatizovaný detekční systém *========================================================================================= Zařízení GeneXpert je uzavřený a plně automatizovaný systém, který je v rychlém čase schop přidaného do speciální kazety (cartridge) provést izolaci nukleové kyseliny, vlastní polym řetězovou reakci s detekcí produktu a následné vyhodnocení. Zjednodušeně řečeno se jedná z v sobě kombinuje automatický izolátor, manuální přípravu reakční směsi pro polymerázovou ř real-time PCR cyklér včetně vyhodnocení ve velmi kompaktních rozměrech. *========================================================================================= * Rotor-Gene Q5plex HRM (real-time PCR cyklér) *========================================================================================= Přístroj “rotorgene“ je schopen na základě polymerázové řetězové reakce v reálném čase (rt fluorescenční detekcí detekovat a analyzovat různé původce infekcí. Ať už se jedná o viry, kvasinky a plísně nebo různé druhy parazitů. Ve srovnání s jinými metodami poskytuje rt-PC většinou rychleji, další výhodou je vysoká citlivost a specificita uvedené metody. Proč je důležité a výhodné detekovat původce infekce včas a správně? Důvodů je více: v případě, že nebo vůbec zachycen původce infekce, nelze nastavit cílenou léčbu. Příkladem může být paci mozkových blan (meningitida) vyvolaný například bakterií Listeria monocytogenes. Pokud nen u pacienta s meningitidou identifikována a pokud se o ní neuvažuje, pacient bude pro menin antibiotikem se širokým spektrem účinku (tzv. cefalosporinem 3. generace), který na Lister však neúčinkuje. Důsledkem této nevyléčené infekce pak mohou být další infekční komplikace úmrtí pacienta. Dalším důvodem proč je nutné přesně stanovit původce infekce je riziko zvy k antimikrobiálním léčivům, pokud jsou používána příliš často a ne cíleně. Další výhodou t je možnost zjistit relativně přesné množství – kvantitu například cytomegaloviru v krvi ta zvýšené kvantity mohla být nasazena adekvátní protivirová léčba. Uvedené je opět důležité pacienty s hematologickými malignitami, kteří jsou k infekcím mnohem náchylnější než zdrav uvedené informace přestavují pouze zlomek možností, pro které lze přístroj využít. *========================================================================================= * Více-jednotkový systém PCR cyklerů s gradientem (podobné i pro termocyklér s gradientem) *========================================================================================= Cyklér pro PCR (polymerázovou řetězovou reakci je obecně řečeno přístroj, který umožňuje z primerů, vhodného prostředí a DNA polymerázy namnožit specifické úseky DNA. V cyklérech je přesně nastavit teplotu mezi 4-100°C a zároveň vzorek rychle zchlazovat nebo zahřívat (řád Více-jednotkový systém PCR cyklérů s gradientem je unikátní množstvím vzorků (až 384), kte amplifikovat ve stejnou chvíli. Zároveň je v případě potřeby možné použít každou jednotku na každé jednotce je možné nastavit jiný teplotní profil pro PCR reakci. Výstupem amplifik zařízení je buď detekce produktu v agarózovém gelu nebo případná sekvenace amplifikovaného pro typizaci viru nebo bakterie. *========================================================================================= * SaMag-12 automatický izolátor nukleových kyselin *========================================================================================= Izolátor se řadí mezí přístroje, schopné izolovat nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) automat bez nutnosti pipetování různých lyzovacích a promývacích roztoků, jako je tomu u manuální nukleových kyseliny na uvedeném přístroji je založena na technologii magnetických částic, nejprve k uvolnění nukleové kyseliny a její vazbě na povrch magnetických částic. Nukleové na magnetických částicích je pak možné v několika krocích promýt a zbavit je tak různých b včetně inhibitorů PCR reakce. Poté je vyčištěna nukleová kyselina uvolněna do eluční zkuma kyselinu vyizolovanou tímto způsobem je možné skladovat v hluboko mrazicím boxu několik le výhodou automatizované izolace je prakticky nulová šance cross-kontaminace vzorků, ke kter při manuální izolaci nukleových kyselin. Lze izolovat nukleové kyseliny virů, bakterií, kv různých typů vzorků. Ve stejném čase je rovněž možno izolovat nukleovou kyselinu z 1 nebo Autor textu: Mgr. Rudolf Kukla, Ph.D.