Věda a zahraničí

LFUK-HK-vankovakri
Poslední změna: 05.08. 2019

Agilent Seahorse XFe96 Analyzer Power Pak

Přístroj bude sloužit k realizaci odborné povinně volitelné výuky předmětu Základy vědecké práce II, tvořenou v rámci projektu INODOK, a to bloku 3:
 
  • úvodní přednáška: Buněčné metody v biomedicínském výzkumu;
  • navazující kurz: Bioenergetika.

Naše pracoviště experimentální hepatologie se dlouhodobě zaměřujeme na problematiku toxického poškození jater včetně mechanismů účinku modelových hepatotoxinů a látek s potenciálním hepatoprotektivním účinkem, jaterní regenerace indukované parciální hepatektomií nebo toxickým poškozením jater, citlivosti jater vůči hepatotoxickým látkám a regenerační odpovědi v terénu jater postižených nealkoholovým ztukovatěním (NAFLD, NASH), extrahepatální cholestázy navozené podvazem d. choledochus a možnosti ovlivnění rozvoje následného jaterního poškození.

Játra jsou důležitým orgánem těla, vykonávají mimo jiné celou řadu nezastupitelných funkcí v intermediárním i energetickém metabolismu, jsou hlavním místem biotransformace a eliminace xenobiotik i řady látek endogenního původu. Důležitost správného posouzení funkce mitochondrií je akcentována nálezy, které dokumentují, že porucha funkce jaterních mitochondrií provází většinu častých metabolických, nutričních a dalších civilizačních onemocnění. Mitochondriální funkce lze studovat na různých modelech zahrnujících jaterní homogenát, mitochondrie a hepatocyty izolované z jater v podmínkách in vivo, v pokusech in vitro lze využít izolované hepatocyty, stabilizované buněčné linie nebo nádorové buněčné linie. Pro posouzení mitochondriálních funkcí je nezbytné mít k dispozici přístrojové vybavení a s ostatními laboratořemi harmonizované standardní pracovní postupy, které umožní srovnání výsledků získaných na jiných pracovištích.

V naší laboratoři jsme dosud využívali vysokoúčinnou respirometrii za použití Oxygrafu Oroboros-2k. Vhodným kombinováním různých substrátů, rozpřahovačů a specifických inhibitorů umožňuje oxygraf hodnotit různé biotransformační energetické cesty, jednotlivé respirační komplexy i funkce (index respirační kontroly, intenzitu tvorby ATP, integritu vnější a vnitřní mitochondriální membrány). Analyzovat lze tkáňové homogenáty, intaktní nebo permeabilizované buňky, izolované mitochondrie a permeabilizované tkáně. Nevýhodou je, že tento přístroj umožňuje simultánní analýzu pouze 2 vzorků v jednom oxygrafu a není možné analyzovat buňky adherované k povrchu.

Projekt Core Facilities nám umožnil pořídit unikátní přístroj pro měření buněčné metabolické analýzy - analyzátor Agilent Seahorse Bioscience XFe96.


Přístroj měří paralelně klíčové indikátory mitochondriální respirace a glykolýzy, rychlost spotřeby kyslíku (OCR) a rychlost okyselování extracelulárního prostředí (ECAR) živých buněk, ve formátu 96-jamkové mikrotitrační destičky. Měření probíhá na optickém principu stanovení změn extracelulární acidifikace a množství kyslíku s použitím LED diod a optických sensorů. Tyto parametry umožňují systematický přístup k charakterizaci metabolických funkcí živých buněk v suspenzních i adherentních kulturách v reálném čase. Změny v extracelulárním médiu jsou způsobeny spotřebou (O2) nebo produkcí analytů (H+) buněk. Citlivé měření toku analytů v médiu lze použít k určení rychlosti buněčného metabolismu neinvazivní metodou bez nutnosti značení buněk. Během měření se vytvoří extrémně malý objem média (méně než 3 μl) nad buněčnou monovrstvou. V tomto limitovaném objemu navodí buněčný metabolismus rychlé měřitelné změny mikroprostředí. Měření se provádí pomocí optických fluorescenčních biosenzorů vložených v jednorázové kazetě, která je umístěna do speciálně navržené Agilent Seahorse Bioscience mikrotitrační destičky pro tkáňové kultury. V jednom experimentu můžeme buňky ovlivnit přídavkem maximálně 4 látek. Látky se postupně přidávají do média a opakovaně se měří OCR a ECAR. Výhodou této metody je možnost analyzovat najednou velké množství vzorků, současně se analyzuje respirace i glykolýza buněk přisedlých k destičce, což umožňuje uchování mezibuněčných kontaktů.

Nespornou výhodou je tedy možnost měření velkého množství vzorků současně, to významně přispívá k vyšší efektivitě výzkumné práce. Určitou nevýhodou je omezené množství látek  (substrátů, inhibitorů, rozpřahovačů a dalších), které lze k vzorku přidat a také nutnost použití médií, která neinterferují s metodikou měření. Tato měření však lze u vybraných vzorků doplnit  měřením na Oxygrafu, kde tyto limity nejsou.

Přístrojové vybavení naší laboratoře po nákupu analyzátoru Agilent Seahorse Bioscience XFe96 poskytuje velmi moderně a komplexně vybavenou bioenergetickou laboratoř umožňující posouzení funkce izolovaných mitochondrií i mitochondrií in situ v izolovaných buňkách nebo stabilizovaných buněčných liniích. Vytváří tak velmi  dobré podmínky pro mladé výzkumníky a studenty DSP. Jsme přesvědčeni, že jsme atraktivní výzkumné pracoviště, které bude atrahovat zájemce o postgraduální studium a které dává záruky získání dostatečného množství kvalitních výsledků a úspěšného ukončení DSP ve standardní době.  

 
Autor textu: prof. MUDr. Zuzana Červinková, CSc.