Věda a zahraničí

LFUK-HK-vankovakri
Poslední změna: 09.11. 2020

Laboratoř ELISA

Soubor přístrojů je navázaný na odbornou povinně volitelnou výuku předmětu Základy vědecké práce II, tvořenou v rámci projektu INODOK, a to bloku 4:
 
  • úvodní přednáška: Imunologické diagnostické metody – současné možnosti
  • navazující kurz: Imunologické diagnostické metody 

Imunochemické metody
Nebývalý rozvoj genetiky, molekulární biologie a biomedicíny jako celku, který od 50. let můžeme jasně rozpoznat, přinesl další mimořádné poznatky v oblasti imunochemie se zásadními dopady na biomedicínu. My z nich zmíníme pouze „technologické“ mezníky, které podstatně změnily možnosti aplikace poznatků základního imunologického výzkumu v biomedicíně. Budeme hovořit o imunochemických metodách, které jsou založeny na interakci mezi protilátkou a antigenem. Tato interakce je fascinující z mnoha ohledů. Je mimořádně specifická. Jednoduše řečeno, máme-li v rukou protilátku, můžeme s její pomocí identifikovat, případně kvantifikovat ve složitých směsích biologických látek jednu konkrétní komponentu. Imunochemická reakce je vysoce citlivá. Znamená to, že imunochemickými metodami můžeme detekovat nano až pikogramová množství stanovované látky. Rozvoji imunochemických metod je věnována pozornost již několik desítek roků. Není naším cílem vracet se do historie, protože některé z původně nenahraditelných imunochemických metod (např. komplement-fixační reakce) byly již překonány daleko efektivnějšími imunochemickými postupy. V jednoduché zkratce je zde trend od málo definovaných imunochemických detekčních systémů (aglutinace, precipitace) k vysoce citlivým a reprodukovatelným imunochemickým metodám, které lze realizovat v širokém měřítku s velkým potenciálem pro automatizaci a robotizaci. Mezi tyto metody zařazujeme postupy ELISA, které jsou především předmětem našeho kurzu. Citlivost imunochemických metod je limitována množstvím imunokomplexů, tj. komplexů mezi antigeny a protilátkami a způsobem jejich detekce. V původních metodách byly imunokomplexy detekovány pouhým okem jako aglutináty nebo precipitáty. Tyto postupy byly z principu málo citlivé. Mimořádně inovativní byla myšlenka Rosalyn Yalow, která k detekci imunokomplexů použila další imunochemickou reakci využívající specifickou protilátku označenou radionuklidem. Definovala tak skupinu imunochemických metod označených jako radioeseje. Zcela oprávněně byla tato vědkyně v roce 1977 oceněna Nobelovou cenou za fyziologii a lékařství. Protože práce s radioizotopy vyžaduje speciální opatření a přístroje, hledaly se jiné způsoby, jak detekční protilátku označit. Historicky prvním a stále nejrozšířenějším přístupem je označení protilátky enzymem. Tak vznikla podmnožina imunochemických metod, které označujeme jako enzymové imunoeseje. Jsou prováděny různými postupy, mezi kterými je pro svoji jednoduchost, snadnou proveditelnost, nízkou cenu a možnost vyšetřování velkého počtu vzorků, nejvíce oblíbena tzv. ELISA. Metody ELISA se používají k detekci přítomnosti specifických protilátek proti infekčním agens, jako nepřímý průkaz infekce. Připomínáme, že se jedná o tak rutinní testy, jakými je testování přítomnosti protilátek proti HIV-1, 2, virům hepatitid a mnoha dalším. Metody ELISA jsou využívány k detekci biologicky aktivních látek charakteru hormonů. Dá se jimi stanovit celé spektrum biologicky aktivních látek charakteru cytokinů. Všechny tyto antigeny lze stanovovat rovněž v supernatantech tkáňových kultur, lyzátech a dalších biologických materiálech. Postupy ELISA jsou tedy nezastupitelné i v biomedicínském výzkumu a proto byly zařazeny do našeho kurzu v rámci projektu INODOK.

Multifunkční centrifuga a chlazená centrifuga
Imunochemickými metodami jsou stanovovány bioanalyty v různých biologických materiálech.Nejčastěji se jedná o sérum nebo plazmu. Mohou to však být jakékoliv tekuté materiály. Sami máme dlouholeté zkušenosti se stanovením biomarkerů imunochemickými metodami ve vzorcích plodové vody, různých punktátů, exudátů, likvoru,… Stanovení provádíme také v supernatantech tkáňových kultur. K získání materiálu, který je později vyšetřován metodami ELISA je nutná centrifugace biologických vzorků. V závislosti na konkrétní analýze jsou zapotřebí různé podmínky centrifugace. Centrifugace také probíhá v rozmanitých zkumavkách a držácích. Proto je zapotřebí mít k dispozici multifunkční centrifugu. Pokud jsou biologický materiál nebo analyty, které chceme pomocí metody ELISA stanovit, citlivé na teplotu, centrifugace musí probíhat za řízeně snížené teploty. K tomu používáme chlazenou centrifugu.


Mrazicí box 
Vzorky biologického materiálu je nutné před stanovením různých biomarkerů různými postupy, včetně metod ELISA, patřičným způsobem uložit, jinak hrozí jejich znehodnocení. Pro dlouhodobé skladování biologických vzorků je nezbytně nutné jejich uložení v mrazících boxech. Velkou výhodou je dosažení velmi nízkých teplot, při kterých lze bez obav o jejich znehodnocení biologické vzorky skladovat měsíce až roky. Tomu je uzpůsoben náš mrazící box, jehož provozní teplota skladování je -80°C.

Autor: prof. RNDr. Jan Krejsek, CSc.