Věda a zahraničí

LFUK-HK-vankovakri
Poslední změna: 27.02. 2020

Laboratoř molekulárně mikrobiologických analýz

Soubor přístrojů je navázaný na odbornou povinně volitelnou výuku předmětu Základy vědecké práce II, tvořenou v rámci projektu INODOK, a to bloku 8:
 
  • úvodní přednáška: Molekulární epidemiologie
  • navazující kurz: Identifikace a klasifikace původců infekcí - RFLP PCR, sekvenace  


8-kapilární sekvenátor ABI 3500 Genetic Analyzer
Genetický analyzátor ABI 3500 se řadí mezi přístroje pro analýzu fluorescenčně značené DNA s využitím technologie kapilární elektroforézy s osmi kapilárami založené na Sangerově metodě.

Sangerova metoda využívá principu PCR s fluorescenčně značenými dideoxynukleotidy. Produkty jsou analyzovány kapilární elektroforézou a hodnoceny v tzv. sekvenogramu. V kapilárovém provedení je Sangerova metoda v současné době stále nejpoužívanější a nejspolehlivější metodou. Při kapilárním sekvenování jsou sekvenovány jednotlivé fragmenty DNA, připravené PCR amplifikací, s tím, že na výše uvedeném sekvenátoru je možnost paralelní sekvenace až 8 sekvencí. Délka získaných sekvencí je přibližně 700 bp, chybovost je cca 1,5% (tzn. jedna báze z cca 66 bází je přečtena chybně). V rámci molekulární mikrobiologie lze na uvedeném přístroji detekovat prakticky jakoukoliv bakterii, jejíž genom byl již sekvenován a vložen do databáze NCBI (National Center for Biotechnology Information), většinou se sekvenuje vysoce konzervativní oblast 16S rRNA genu. Vhodnější pro identifikaci sekvenací na tomto sekvenátoru jsou vzorky, kde se předpokládá přítomnost pouze jedné bakterie, případně předem připravený neznámý bakteriální kmen, nikoliv vzorky obsahující bakterií více.

NGS sekvenátor MiseQ Systém
Jedná se o přístroj s technikou tzv. masivního paralelního sekvenování (MPSS - z anglického „Massively Parallel Signature Sequencing“). Tato technika umožňuje univerzálně charakterizovat a kvantifikovat různé nukleové kyseliny, ať už mikrobů, zvířat nebo lidí. Nukleová kyselina je rozdělena na fragmenty o určité délce, z nichž každý fragment je amplifikován samostatně a mnoho takto vzniklých kopií každého fragmentu je poté čteno technologií podle použité platformy. Jednoduše řečeno, touto technikou je možno identifikovat nikoliv jeden druh nukleové kyseliny jako u Sangerova sekvenování, ale desítky až stovky druhů. Sekvenační schéma je následující: Příprava sekvenační knihovny, sekvenování a detekce nukleotidů, softwarová analýza získaných dat.

Obzvláště výhodné je použití v mikrobiologii při analýze tzv. mikrobimů, což je výraz pro společenství mikrobů, zejména bakterií nebo kvasinek, které jsou přítomny běžně v různých ústrojích člověka. Může se jednat o střevní, vaginální nebo kožní a další mikrobiom. Velkou výhodou je že NGS sekvenování umožní detekovat takřka veškeré bakterie, které jsou například přítomné ve stolici a to i takové, které není možné pěstovat na umělých půdách, tzv. živných médiích nebo agarech, čili není možné je prokázat kultivačně. Poměrně dobře je známo, že ve střevním mikrobiomu člověka se nachází až několik stovek druhů bakterií a kultivačně lze prokázat často pouze několik jednotek, maximálně desítek z nich. Právě porovnání zmíněného střevního mikrobiomu například od pacientů se zánětlivými střevními chorobami s mikrobiomem střeva zdravých lidí může být nápomocné ve vývoji léčby pro nemocné jedince. Opakovaně se zjistilo, že u různých chorob včetně zánětlivých onemocnění střeva se vyskytuje podobná skupina bakterií, která zhoršuje průběh nemoci anebo naopak určitá skupina bakterií pro lepší průběh nemoci chybí. V takovém případě pak lze buď nežádoucí skupinu bakterií potlačit specifickými léčivy anebo naopak dodat žádoucí skupinu bakterií ve formě probiotik.

Přístroj vzhledem k výše uvedenému generuje enormní množství dat, pro jejichž zpracování disponuje výkonnou výpočetní stanicí s úložištěm.

GeneXpert IV - 4L automatizovaný detekční systém
Zařízení GeneXpert je uzavřený a plně automatizovaný systém, který je v rychlém čase schopen ze vzorku přidaného do speciální kazety (cartridge) provést izolaci nukleové kyseliny, vlastní polymerázovou řetězovou reakci s detekcí produktu a následné vyhodnocení. Zjednodušeně řečeno se jedná zařízení, které v sobě kombinuje automatický izolátor, manuální přípravu reakční směsi pro polymerázovou řetězovou reakci, real-time PCR cyklér včetně vyhodnocení ve velmi kompaktních rozměrech.

Rotor-Gene Q5plex HRM (real-time PCR cyklér)
Přístroj “rotorgene“ je schopen na základě polymerázové řetězové reakce v reálném čase (rt-PCR) s fluorescenční detekcí detekovat a analyzovat různé původce infekcí. Ať už se jedná o viry, bakterie, kvasinky a plísně nebo různé druhy parazitů. Ve srovnání s jinými metodami poskytuje rt-PCR výsledek většinou rychleji, další výhodou je vysoká citlivost a specificita uvedené metody. Proč je vlastně tak důležité a výhodné detekovat původce infekce včas a správně? Důvodů je více: v případě, že není správně nebo vůbec zachycen původce infekce, nelze nastavit cílenou léčbu. Příkladem může být pacient se zánětem mozkových blan (meningitida) vyvolaný například bakterií Listeria monocytogenes. Pokud není tato bakterie u pacienta s meningitidou identifikována a pokud se o ní neuvažuje, pacient bude pro meningitidu léčen antibiotikem se širokým spektrem účinku (tzv. cefalosporinem 3. generace), který na Listeria monocytogenes však neúčinkuje. Důsledkem této nevyléčené infekce pak mohou být další infekční komplikace vedoucí až k úmrtí pacienta. Dalším důvodem proč je nutné přesně stanovit původce infekce je riziko zvyšování rezistence k antimikrobiálním léčivům, pokud jsou používána příliš často a ne cíleně. Další výhodou této instrumentace je možnost zjistit relativně přesné množství – kvantitu například cytomegaloviru v krvi tak aby, v případě zvýšené kvantity mohla být nasazena adekvátní protivirová léčba. Uvedené je opět důležité zejména pro pacienty s hematologickými malignitami, kteří jsou k infekcím mnohem náchylnější než zdravá populace. Výše uvedené informace přestavují pouze zlomek možností, pro které lze přístroj využít.

Více-jednotkový systém PCR cyklerů s gradientem (podobné i pro termocyklér s gradientem)
Cyklér pro PCR (polymerázovou řetězovou reakci je obecně řečeno přístroj, který umožňuje za použití primerů, vhodného prostředí a DNA polymerázy namnožit specifické úseky DNA. V cyklérech je možné velmi přesně nastavit teplotu mezi 4-100°C a zároveň vzorek rychle zchlazovat nebo zahřívat (řádově v sekundách). Více-jednotkový systém PCR cyklérů s gradientem je unikátní množstvím vzorků (až 384), které je možné amplifikovat ve stejnou chvíli. Zároveň je v případě potřeby možné použít každou jednotku samostatně - na každé jednotce je možné nastavit jiný teplotní profil pro PCR reakci. Výstupem amplifikace v uvedeném zařízení je buď detekce produktu v agarózovém gelu nebo případná sekvenace amplifikovaného úseku například pro typizaci viru nebo bakterie.


SaMag-12 automatický izolátor nukleových kyselin
Izolátor se řadí mezí přístroje, schopné izolovat nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) automatizovaně, tzn. bez nutnosti pipetování různých lyzovacích a promývacích roztoků, jako je tomu u manuální izolace. Izolace nukleových kyseliny na uvedeném přístroji je založena na technologii magnetických částic, kdy dochází nejprve k uvolnění nukleové kyseliny a její vazbě na povrch magnetických částic. Nukleové kyseliny navázané na magnetických částicích je pak možné v několika krocích promýt a zbavit je tak různých balastních látek včetně inhibitorů PCR reakce. Poté je vyčištěna nukleová kyselina uvolněna do eluční zkumavky. Nukleovou kyselinu vyizolovanou tímto způsobem je možné skladovat v hluboko mrazicím boxu několik let. Obrovskou výhodou automatizované izolace je prakticky nulová šance cross-kontaminace vzorků, ke které může dojít při manuální izolaci nukleových kyselin. Lze izolovat nukleové kyseliny virů, bakterií, kvasinek i hub z různých typů vzorků. Ve stejném čase je rovněž možno izolovat nukleovou kyselinu z 1 nebo až 12 vzorků.

Hlubokomrazící box
Jak je již z názvu patrno, uvedené zařízení umožňuje uchovat různé typy vzorků při -80°C stabilní po velmi dlouhou dobu, řádově až roky. Mezi často uchovávané vzorky, které je nutno uchovat při této teplotě patří zejména unikátní materiály, například: různé druhy protilátek, nukleové kyseliny bakterií, virů, parazitů, hub, ale i DNA z lidských vzorků. Další výhodou je možnost zamrazit živé vzácné bakterie, které je možné po i více letech rozmrazit, znovu oživit a dále používat. Mrazicí box disponuje rovněž velkým vnitřním objemem pro uchování co největšího počtu vzorků. Přístroj je rovněž vybaven displejem, který ukazuje aktuální teploty a případné chybové hlášky například při výpadku proudu. Velkou výhodou je tzv. duální systém chlazení, kdy při selhání jednoho chladícího okruhu je schopen druhý chladící okruh dále udržovat požadovanou teplotu.

Spectrophotometer  Wi-Fi ND-One-W (Nanodrop)
Jedná se o zařízení, které umožňuje měřit množství nukleových kyselin (DNA, RNA), proteinů a dalších látek. Přístroj disponuje širokým rozsahem spektra, ve kterém lze měřit (190-850 nm). Unikátní je možnost měřit ve velmi malých objemech vzorku (1-2 µl), což je velmi malá kapička vzorku. Měření je zároveň velmi rychlé v rámci sekund.

Laminární box
Jedná se o přístroj sloužící k ochraně různých typu vzorků, ale i obsluhy před kontaminací. Součástí zařízení jsou vysoce účinné HEPA filtry s účinností filtrace min. 99,99 %, tak aby nemohlo dojít ke kontaminaci pracovníka virovým nebo bakteriálním agens. Součástí je rovněž UV lampa, tzv, germicidní zářivka, která slouží k účinné sterilizaci vnitřního prostoru boxu.
 
DNA/RNA UV čistící box
DNA/RNA UV čistící box je určen pro manipulaci s chemikáliemi nebo i s materiály citlivými na kontaminaci. Jedná se zejména o přípravu směsí pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Do této reakce vstupuje několik základních chemikálií: stavební kameny pro syntézu DNA, tzv. deoxynukleotidy, hořečnaté ionty, speciální pufr, dále primery a sonda specifické pro požadovaný a detekovaný úsek DNA a konečně také DNA-polymeráza. Výše uvedené reagencie jsou přidávány v extrémně malých objemech a v průběhu jejich míchání nesmí být kontaminovány nečistotami z prostředí. Proto se všechny tyto reakce provádí v DNA/RNA UV čistícím boxu. Uvedené zařízení disponuje UV lampou, jejíž záření zajišťuje sterilní prostředí, neboť UV záření rozkládá i DNA, která by mohla kontaminovat připravované PCR směsi.

Analytické váhy RADWAG, typ AS82/220
Uvedené zařízení se řadí mezi váhy schopné vážit s přesností na setiny miligramu, v  přepočtu na kilogramy se jedná o možnost vážit deseti miliontiny kilogramu. Váženy mohou být jak tekuté tak pevné vzorky ve velmi malých množstvích. Přesnost vážení je zajištěná uzavíratelnými skleněnými dvířky – vzorek je tedy ve váze ze všech stran uzavřen, neboť i prosté proudění vzduchu můžu zkreslovat hmotnost u takto přesného zařízení. Další výhodou je rychlé vážení, v případě stabilizace (zábrana proudění vzduchu uzavřením) je vzorek zvážen do 6 sekund.
Autor textu: Mgr. Rudolf Kukla, Ph.D.
 

Fotografie

Laminární box Hlubokomrazící box Spectrophotometer  Wi-Fi ND-One-W (Nanodrop) Analytické váhy RADWAG, typ AS82/220 DNA/RNA UV čistící box SaMag-12 automatický izolátor nukleových kyselin